無菌接種步驟

  1.將初步洗滌及切割的材料放入燒杯，帶入超淨台上，用消毒劑滅菌，再用無菌水衝洗，最後瀝去水分，取出放置在滅過菌的紗布上或濾紙上。

  2.材料吸幹後，一手拿鑷子、一手拿剪刀或解剖刀，對材料進行適當的切割。如葉片切成0.5cm平方的小塊;莖切成含有一個節的小段。微莖尖要剝成隻含1～2片幼葉的莖尖大小等。在接種過程中要經常灼燒接種器械，防止交叉汙染。

  3.用灼燒消毒過的器械將切割好的外植體插植或放置到培養基上。具體操作過程(以試管為例)是：先解開包口紙，將試管幾乎水平拿著，使試管口靠近酒精燈火焰，並將管口在火焰上方轉動，使管口裏外灼燒數秒鍾。若用棉塞蓋口，可先在管口外麵灼燒，去掉棉塞，再燒管口裏麵。然後用鑷子夾取一塊切好的外植體送入試管內，輕輕插入培養基上。若是葉片直接附在培養基上，以放1～3塊為宜。至於材料放置方法除莖尖、莖段要正放(尖端向上)外，其他尚無統一要求。接種完後，將管口在火焰上再灼燒數秒種。並用棉塞，塞好後，包上包口紙，包口紙裏麵也要過火。

  褐化

  解決方案：在培養基中添加活性碳可以防止植物組織自身的酚類物質排泌和變褐老化，對形態發生和器官形成有良好作用。一般認為，活性碳主要吸附非極性物質及色素大分子，可以減少一些有害物質的影響，但是具體吸附的選擇性很差，溫度低時吸附力增強，溫度高時吸附力減弱，甚至會解吸附，通常使用濃度為0.5-10g/L。加入活性炭後使培養基變黑，對一些植物誘導生根有利。大量活性炭的加入會削弱瓊脂的凝固能力，因此要多加些瓊脂。很細的活性炭容易沉澱，因此通常在瓊脂將要凝固時，需輕輕搖動培養瓶。

  酚汙染

  解決方案：植物外植體組織在接種時的切割麵會溢泌一些酚類物質，在接觸空氣中的氧氣後，其會氧化為相應的醌類物質，產生可見的茶色、褐色或黑色，此即謂“酚汙染”。在木本植物，尤其是熱帶木本植物及少量草本植物中，此現象較為嚴重。

  常用的防治措施如下

  1、試用抗酚類氧化的藥劑(半胱氨酸及其鹽酸鹽、二硫蘇糖醇、穀胱甘肽、抗壞血酸等。該類藥劑一般需用濃度為50-200mg/L。用經過濾滅菌的藥液洗滌剛切割的外植體傷口表麵，或加入固體培養基的表層，或將剛切割的外植體浸入其中一定時間)

  2、適當降低培養基溫度。

  3、接種後先進行一定時間的暗培養。

  4、及時轉接入新鮮培養基。

  5、選擇切取外植體部位等。